Si tratta di una indagine molecolare per la rilevazione del genoma (RNA) del virus SARS-CoV-2 nel campione biologico basata sulla RT-PCR, metodica che permette di identificare in modo altamente specifico e sensibile uno o più geni bersaglio del virus presenti nel campione biologico e di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale della sequenza target. La rilevazione dell’RNA virale di SARS-CoV-2 eseguita in laboratorio da campioni clinici (in genere tamponi nasofaringei od orofaringei) ad oggi rimane il saggio di riferimento internazionale per sensibilità e specificità, in grado di rilevare il patogeno anche a bassa carica virale in soggetti sintomatici, pre-sintomatici o asintomatici. Per la complessità della metodica, la rilevazione di SARS-CoV-2 viene eseguita esclusivamente in laboratori specializzati con operatori esperti.³

Anche i campioni prelevati dall'espettorato, dagli aspirati endotracheali e dal lavaggio bronco-alveolare possono essere inviati direttamente al laboratorio di microbiologia per l'elaborazione e possono avere una sensibilità maggiore rispetto ai campioni del tratto respiratorio superiore. Una raccolta inadeguata del campione può fornire come risultato un test falso negativo.² 

Il risultato può esser ottenuto in un minimo di 3-5 ore a un massimo di 1-2 giorni. Ai fini della segnalazione dei casi nel sistema della sorveglianza integrata COVID-19, coordinata dall’Istituto Superiore di Sanità (ISS), vengono considerati solo i risultati positivi ottenuti tramite RT-PCR dai laboratori di riferimento regionali o dai laboratori identificati/autorizzati da questi. A questi si aggiunge la possibilità di effettuare l’analisi dei test molecolari senza effettuare l’estrazione e la purificazione dell’RNA dal campione biologico, ma di utilizzare la tecnica della inattivazione al calore (“a crudo”), che permette di semplificare, massimizzare e velocizzare il primo step dell’analisi stessa, specialmente in condizioni di forte pressione sui laboratori dovuti all’aumentare dei tamponi da processare. Il rischio di perdita di sensibilità può considerarsi minimo e presente solo ad alti numeri di cicli di amplificazione della PCR. Tuttavia, la sensibilità risulta superiore al test antigenico.³

Nuovi test antigenici rapidi sono stati sviluppati per offrire risultati più rapidi (30-60 minuti), con minor costo e senza la necessità di personale specializzato, potenzialmente utili soprattutto per le indagini di screening. Analogamente ai test molecolari i saggi antigenici sono di tipo diretto, ossia valutano direttamente la presenza del virus nel campione clinico, a differenza dei test sierologici che sono di tipo indiretto, cioè rilevano la presenza di anticorpi specifici che indicano una infezione pregressa o in atto. A differenza dei test molecolari, però, i test antigenici rilevano la presenza del virus non attraverso il suo acido nucleico, ma tramite le sue proteine (antigeni).³ 

Questi test contengono come substrato anticorpi specifici in grado di legarsi agli antigeni virali di SARS-CoV-2 ed il risultato della reazione antigene-anticorpo può essere direttamente visibile a occhio nudo o letto mediante una semplice apparecchiatura al “point of care” (POC) senza la necessità di essere effettuato in un laboratorio. I test antigenici sono di tipo qualitativo (sì/no) e intercettano, tramite anticorpi policlonali o monoclonali, specifici peptidi (porzioni proteiche) della proteina S (Spike) o N (nucleocapside) presenti sulla superficie virale di SARS-CoV-2.³

Il test può risultare negativo se la concentrazione degli antigeni è inferiore al limite di rilevamento del test (per esempio se il prelievo è stato eseguito troppo precocemente rispetto all’ipotetico momento di esposizione) o se il campione è stato prelevato, trasportato o conservato impropriamente. Per questo, i produttori di tali kit evidenziano che un risultato negativo del test non esclude la possibilità di un’infezione da SARS-CoV-2 e la negatività del campione, a fronte di forte sospetto di COVID-19, dovrebbe essere confermata mediante test molecolare. I test molecolari sembrano avere una maggiore sensibilità prima della comparsa dei sintomi, mentre nella fase iniziale immediatamente successiva all’inizio dell’infezione i test rapidi antigenici e quelli molecolari hanno una sensibilità sovrapponibile, rendendo utile l’uso anche dei primi. Inoltre, il test rapido antigenico può essere utilizzato per l’identificazione dei contatti asintomatici dei casi, anche se questo tipo di test non è specificamente autorizzato per questa destinazione d’uso, poiché è stato dimostrato che i casi asintomatici hanno cariche virali simili ai casi sintomatici.³

Attualmente, i dati disponibili sulla sensibilità e specificità di questi test rapidi sono quelli dichiarati dal produttore: 70-86% per la sensibilità e 95-97% per la specificità. Riguardo i test su tampone salivare, il dispositivo di rilevazione è lo stesso, ma cambiando il campione analizzato possono cambiare le caratteristiche di sensibilità e specificità del test. In conclusione, la sensibilità e la specificità di questi test antigenici rapidi dovranno essere valutate per i loro valori predittivi nel corso del loro sviluppo tecnologico.³

Le immunoglobuline IgM costituiscono la prima linea di difesa durante le infezioni virali, anticipando la generazione di risposte adattive e ad alta affinità delle immunoglobuline G (IgG) che sono importanti per l'immunità a lungo termine e la memoria immunologica. La messa a punto di test basati sugli anticorpi è giustificata dal fatto che le IgM inizialmente si elevano nel sangue dopo il primo contatto del virus con il nostro organismo e diminuiscono rapidamente dopo poco tempo, mentre le IgG vengono prodotte in un secondo momento e rimangono in circolo anche dopo la clearance virale.¹

I test sierologici in grado di identificare gli anticorpi come IgA, IgM e IgG in risposta all’infezione da SARS-CoV-2 tramite campioni di sangue o saliva, come i test di immunoassorbimento enzimatico, sono meno complessi dei test molecolari con il vantaggio di poter essere utilizzati per la diagnosi in determinate situazioni.¹ 

Il test sierologico classico per il rilevamento di IgM e IgG nel siero umano di pazienti affetti da SARS-CoV-2 è stato finora impiegato solo a scopo osservazionale e non come strumento diagnostico.⁴ Peraltro, anche il test molecolare dell'acido nucleico, considerato l'attuale “gold standard” per la diagnosi di COVID-19, potrebbe in realtà produrre risultati falsi-negativi, oltre ad essere di difficile applicazione per ogni paziente sospetto a causa dell'esistenza di casi asintomatici. Inoltre, la rilevazione di anticorpi specifici nel sangue, come l’IgM contro SARS-CoV-2 rappresenta un ulteriore opzione per la diagnosi di COVID-19, poiché le IgM rappresentano un indicatore importante nella fase di infezione acuta.¹

Pertanto, la capacità di riconoscimento delle immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 potrebbe guidare il ricercatore a identificare i pazienti infetti e a riconoscere coloro che hanno superato la malattia e possono terminare in sicurezza l'isolamento.¹

Lo svantaggio di tale approccio è che la produzione sequenziale di IgM e IgG viene messa in discussione, come riportato per i precedenti virus SARS e MERS, quando il sistema immunitario incontra SARS CoV-2. In pratica, le risposte IgM sono state rilevate prima o insieme alle IgG, dopo le IgG o addirittura mancanti. Inoltre, alcuni ricercatori hanno avanzato l’idea che il rilevamento di immunoglobuline A (IgA) e IgM rappresenterebbe uno strumento diagnostico più accurato. Infatti, i risultati ottenuti per l'epidemia di SARS hanno dimostrato che, proprio come la MERS, le IgG possono essere rilevate già 2 giorni dopo l'inizio della febbre, mentre le IgM contemporaneamente o dopo le IgG. Ma, complessivamente, si tratta di casi particolari o eccezioni che necessitano di essere approfondite ulteriormente per trovare applicazione pratica.¹

Le prestazioni di questi test sierologici variano ampiamente, con alcuni test che non rispettano i criteri di sensibilità ed efficacia proposti dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense. In particolare, alcuni test sierologici hanno mostrato che la sensibilità in una fase iniziale dell'infezione è molto inferiore rispetto a quella in una fase avanzata dell'infezione. Inoltre, la sensibilità può avvicinarsi al 90% solo nei pazienti che sono stati infettati da oltre 15 giorni, il che implica la necessità di una maggiore accuratezza della diagnosi. Allo stesso tempo, tra le diverse tecniche di rilevamento sierologico, un numero considerevole di studi ha riportato buoni effetti di rilevamento. In futuro, buone prestazioni basate su un gran numero di campioni contribuiranno allo sviluppo e al miglioramento della tecnologia di questo tipo di test.⁵